在今年的6月10日，医院神经科关鸿志医院，在BioRxiv杂志上在线发表一篇多中心研究文章：MetagenomicNext-generationSequencingofCerebrospinalFluidfortheDiagnosisofCentralNervousSystemInfections:AMulticentreProspectiveStudy。这篇文章的发表预示着国内mNGS技术在中枢神经系统感染的诊断进入了应用阶段。
背景传染性脑炎和脑膜炎是造成神经系统疾病的主要因素。在现有的临床治疗中，这些疾病通常是经验性治疗，很多情况下难以确定其致病原。临床上会利用传统诊断技术来检测致病原，可结果只有50-80%的患病者到够检测出致病原。因此，传统检测方法带来的不确定性，常常造成病人的治疗延误、不充分和不适当。
早在年，美国CharlesChiu教授首次应用病原宏基因组（mNGS）技术，诊断出14岁小男孩因钩端螺旋体感染致脑病，且挽救了他的生命。在这之后，这项技术引起了全球神经科医生的极大兴趣.。
mNGS是一种高通量测序技术，它可以同时对成千上万到数十亿个DNA或RNA片段进行独立测序。和传统检测方法相比，mNGS无需输入临床预测因子或其他实验室结果，即可识别病原体。又因脑脊液（CSF）在健康人群中通常是无菌状态，所以神经科医生认为，在诊断中枢神经系统（CNS）感染中，使用CSF样本非常契合这项新技术的应用。
在这样的临床和技术背景下，关教授和其研究团队进行了一项多中心前瞻性研究，综合评价脑脊液mNGS技术在诊断中枢神经系统（CNS）感染方面的表现，并与传统微生物学方法进行比较。
什么样的病人使用了这项技术？在长达1年的研究时间里，关教授及其研究团队共纳入来自中国20家医院的例脑炎或脑膜炎患者。他们先从例患者中排除了11例系统性血管炎、自身免疫性脑炎、原发性中枢神经系统淋巴瘤等非感染性疾病的患者，剩下的例为符合以下标准的成年患者（表1）：
主要标准（必选）：
患者就诊时出现无明确病因导致的超过24小时的精神状态改变（意识水平降低或改变，或者人格改变），且/或全身性或部分性癫痫（但并非完全归因于先前的癫痫症或单纯的发烧性癫痫）。
次要标准（≥2条）：
1.症状出现前或出现后72小时内发热≥38℃
2.新发局灶性神经系统发作
3.脑脊液白细胞计数≥5/立方毫米
4.影像学上脑实质异常，提示脑炎
5.脑电图异常与脑炎症状一致，且不能明确此症状病因
表1
这例脑脊液标本均使用mNGS技术检测，以传统检测方法为金标准，根据相关指南和共识，将mNGS的结果分为真阳性、假阳性和假阴性。
什么样的标准提示mNGS结果是真阳性的？为了减少脑脊液样本受污染的影响，团队将检测到的种特异性序列数（SSRN）标准化至20M，并采用以下标准来判定mNGS的结果为阳性：
1)对于细胞外细菌、真菌（隐球菌除外）和寄生虫，如果检测到的SSRN≥30（RPM≥1.50），在阴性对照中未出现且该读数在细菌、真菌或寄生虫中排名前10位，或者在阴性对照中出现，检出序列数是阴性对照的10倍且在过去一个月内未多次出现（多次判断标准＞25%），则样本结果为阳性；
2)对于胞内细菌（不包括结核分枝杆菌和布鲁氏杆菌）和隐球菌，如果检测到的SSRN≥10（RPM≥0.50），在阴性对照中未出现且该读数在细菌、真菌中排名前10位，或者在阴性对照中出现，检出序列数是阴性对照的10倍且在过去一个月内未多次出现（多次判断标准为＞25%）则样本结果为阳性；
3)对于病毒、布鲁氏杆菌和结核分枝杆菌，如果检测到的SSRN≥3（RPM≥0.15），则认为结果为阳性。
有了标准后，真实检测结果如何？总共位患者的检测结果中，其中mNGS检测到阳性结果例（假阳性12例），传统检测方法检测到阳性结果例，且其中例是“致病原”（表2）。
因此mNGS检测出真阳性结果为例，阳性率为36.60%。所有mNGS结果均在不到48小时内获得，并且其速度快于任何传统检测方法。
表2
在首次被mNGS诊断的患者中，16.3％的感染是由细菌引起的，15.2％是由病毒引起的，2.9％是由真菌引起的，2.2％是由寄生虫引起的（图A）。
图A
mNGS真阳性的结果细节如下（图B）：
l11种细菌，其中常见的是结核分枝杆菌（14例，13.9％）和单核细胞增生李斯特菌（8例，7.9％）；
l7种病毒（BK多瘤病毒不是致病病原体），其中常见的是水痘带状疱疹病毒VZV（17例，16.8％）和单纯疱疹病毒1型HSV1（12例，11.9％）；
l2种真菌，其中两种都是隐球菌（8例，7.9％）；
l2种寄生虫，其中猪肉绦虫（5例，5.0％）是最常见的。
图B
如何理解假阳性、假阴性结果？假阳性：12例（4.3％）患者出现假阳性，主要与细菌感染有关（n=12；表2），包括大肠杆菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽糖杆菌和铜绿假单胞菌，也有过布鲁氏菌的假阳性。
根据先前提出的标准，病毒、真菌或寄生虫没有假阳性。虽然人类疱疹病毒4型（EBV）在大多数病例中不是致病病原体，但在部分患者的脑脊液中存在。此外，大部分脑脊液样本都有一些背景污染（表2），但这些结果不符合阳性结果的标准。
观察到的各种类型污染可分为两组：（1）通常与背景污染相关的微生物，不符合阳性结果的标准（表2）和（2）满足mNGS阳性标准的假阳性结果，但与患者的临床表现和特征不一致。
作者后来又提出，污染主要来自以下来源：
（1）实验室操作（细小病毒NIHCQV是硅柱状核酸提取试剂盒中的一种污染物）;
（2）试剂（缓生根瘤菌、伯克霍尔德菌和拉尔斯顿菌是工业超纯水系统中常用的污染物）;
（3）环境（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、屎肠医院环境中广泛存在的病原体）;
（4）皮肤或其他身体菌群（痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌与人类皮肤菌群相关）。
假阳性结果很可能误导治疗，因此，临床医医院环境中普遍存在的细菌或真菌，在对待此类阳性mNGS结果时应该谨慎，特别是在单纯使用mNGS检测的情况下。另一方面，病毒和寄生虫的阳性mNGS检测不太可能是假阳性。
假阴性：16例（5.8%）患者出现假阴性（表2），结果显示与细菌、病毒和真菌感染有关。假阴性细菌感染病例均在测序前给予抗生素治疗。在病毒感染的假阴性病例中，SSRN数量为1或2个，这不满足之前mNGS阳性的建议标准。
如果将阳性结果的标准放宽到SSRN≥1(RPM≥0.05)，则无单纯疱疹病毒1型（HSV1）或水痘带状疱疹病毒（VZV）的假阴性，或HSV1、HSV2、VZV假阳性的病例。如果对病毒和结核分枝杆菌采用SSRN≥1（RPM≥0.05）的替代标准，可能会出现更多的假阳性，包括30例EBV、7例CMV（巨细胞病毒）和5例结核分枝杆菌感染。因此需要指出的是，这5例结核分枝杆菌感染的可能性不能从临床表现上排除，传统检测方法可能无法检测到结核分枝杆菌。
通过假阴性概率可以看出，患者如在检测前使用抗生素会影响细菌的检出率。在病毒检测的假阴性结果中可以看到低SSRN值（1或2个读数），表明当病毒SSRN指数低时，应该进行其他测试以确认诊断。因此作为筛选方法，mNGS检测到的病原体可为进一步诊断提供临床线索，即使结果不符合阳性结果的标准。
mNGS技术在临床的应用如何影响医生的诊断？作者根据实验结果，提出脑脊液mNGS在本研究的临床环境应用中，可以被认为是用于诊断CNS传染病的准一线方法。
mNGS测序技术，不仅可以检测预期之外的新微生物，更重要的是，mNGS可以检测到临床医生可能因非典型临床表现而未考虑到的病原体。此外，脑脊液mNGS不仅具有鉴定CNS感染新病因的能力，还可以检测到可能指导适当靶向治疗的意外共感染。最后，脑脊液mNGS可能是在对自身免疫性疾病的最终诊断之前，排除广谱潜在CNS传染病的适当工具。
关教授的研究中，超过三分之一的患者在48小时内首次通过脑脊液mNGS诊断，表明该技术对于快速临床决策非常有用。
因此当患者出现以下情况时，脑脊液mNGS测序技术应被视为急性CNS感染的一线检测：
（1）患者病情危重并需要及时和精确的治疗；
（2）临床表现是非特异性的，并且联合其他传统检测用于识别致病原；
（3）需要排除广泛的潜在病原体以诊断疑似自身免疫性脑炎；
（4）怀疑罕见或新型病原体且无法通过传统检测方法查出致病原。
局限目前在临床环境中使用mNGS技术存在一些限制。首先，医院都没有现有的检测仪器，而且此类检测成本通常远高于其他传统检测方法。其次，检测出某种病原体的DNA并不一定证明它就是患者的实际致病原。最后，mNGS无法检测出数据库中未包含的微生物。例如在关教授的本次研究中，实验设计未构建RNA文库，因此未能检测到RNA病毒。
结语脑脊液mNGS检测对于疑似中枢神经系统感染患者的诊断评估是非常有用的技术。mNGS可以成为应对新出现的传染病和传染病爆发的一线实验室方法。若采用严格的mNGS阳性结果标准，并使用传统检测方法作为金标准，那么mNGS测序技术将会使更多医生和患者受益其中。
原文献ID
题目：MetagenomicNext-generationSequencingofCerebrospinalFluidfortheDiagnosisofCentralNervousSystemInfections:AMulticentreProspectiveStudy
期刊：BioRxiv
发表时间：年6月
通讯作者：关鸿志
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